kromatografi lapis tipis

Diposting oleh ikka gates , Label: , Rabu, 21 November 2012 05.37



Meskipun anda adalah seorang pemula yang mungkin lebih mengenal kromatografi kertas, penjelasan　tentang kromatografi lapis tipis sama mudahnya dengan kromatografi kertas.
KLT pertama kali ditemukan oleh Ismailoff dan Schraiber, pada tahun 1938
Pelaksanaan kromatografi lapis tipis
Latar Belakang

Kromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi berkerja berdasarkan prinsip ini.

Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. Kita akan membahasnya lebih lanjut.

Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras.

Silika gel (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet, alasannya akan dibahas selanjutnya. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.


Kromatogram

Kita akan mulai membahas hal yang sederhana untuk mencoba melihat bagaimana pewarna tertentu dalam kenyataannya merupakan sebuah campuran sederhana dari beberapa pewarna.

Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk.

Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak berada.

Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut.

Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna.

Gambar menunjukkan lempengan setelah pelarut bergerak setengah dari lempengan.

Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.

Perhitungan nilai Rf
Jika anda ingin mengetahui bagaimana jumlah perbedaan warna yang telah terbentuk dari campuran, anda dapat berhenti pada bahasan sebelumnya. Namun, sering kali pengukuran diperoleh dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna masing-masing.

Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan.

Pengukuran berlangsung sebagai berikut:
Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:

Rf=jarak yang ditempuh oleh komponen
jarak yang ditempuh oleh pelarut

Sebagai contoh, jika komponen berwarna merah bergerak dari 1.7 cm dari garis awal, sementara pelarut berjarak 5.0 cm, sehingga nilai Rf untuk komponen berwarna merah menjadi:
Jika anda dapat mengulang percobaan ini pada kondisi yang tepat sama, nilai Rf yang akan diperoleh untuk setiap warna akan selalu sama. Sebagai contoh, nilai Rf untuk warna merah selalu adalah 0.34. Namun, jika terdapat perubahan (suhu, komposisi pelarut dan sebagainya), nilai tersebut akan berubah. Anda harus tetap mengingat teknik ini jika anda ingin mengidentifikasi pewarna yang tertentu. Mari kita lihat bagaimana menggunakan kromatografi lapis tipis untuk menganalisis pada bagian selanjutnya.
Faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf pada KLT di antaranya:
1.      struktur kimia senyawa yang dipisahkan
2.      sifat penyerap
3.      ketebalan lapisan penyerap
4.      pelarut yang digunakan
5.      derajad kejenuhan uap dalam bejana pengembang/chamber
6.      teknik percobaan
7.      jumlah sampel
8.      suhu
9.      kesetimbangan
Bagaimana halnya jika substansi yang ingin anda analisis tidak berwarna?

Ada dua cara untuk menyelesaikan analisis sampel yang tidak　berwarna.

Menggunakan pendarflour

Mungkin anda masih ingat apa yang telah saya sebutkan bahwa fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi yang ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar ultraviolet (UV). Itu berarti jika anda menyinarkannya dengan sinar UV, akan berpendar.

Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa jika anda menyinarkan sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.
Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan, anda harus menandai posisi-posisi dari bercak-bercak dengan menggunakan pinsil dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Seketika anda mematikan sinar UV, bercak-bercak tersebut tidak tampak kembali.

Penunjukkan bercak secara kimia

Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan jalan mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino.

Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat atau ungu.
Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal iodium.

Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan.
Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal iodium.

Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan.

Penggunaan kromatografi lapis tipis untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa

Anggaplah anda mempunyai campuran asam amino dan ingin menemukan asam amino-asam amino tertentu yang terkandung didalam campuran tersebut. Untuk sederhananya, mari kira berasumsi bahwa anda mengetahui bahwa campuran hanya mungkin mengandung lima asam amino.

Setetes campuran ditempatkan pada garis dasar lempengan lapis tipis dan bercak-bercak kecil yang serupa dari asam amino yang telah diketahui juga ditempatkan pada disamping tetesan yang akan diidentifikasi. Lempengan lalu ditempatkan pada posisi berdiri dalam pelarut yang sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya. Dalam gambar, campuran adalah M dan asam amino yang telah diketahui ditandai 1-5.

Bagian kiri gambar menunjukkan lempengan setelah pelarut hampir　mencapai bagian atas dari lempengan. Bercak-bercak masih belum tampak. Gambar kedua menunjukkan apa yang terjadi setelah lempengan disemprotkan ninhidrin.
Tidak diperlukan menghitung nilai Rf karena anda dengan mudah dapat membandingkan bercak-bercak pada campuran dengan bercak dari asam amino yang telah diketahui melalui posisi dan warnanya.

Dalam contoh ini, campuran mengandung asam amino 1, 4 dan 5.

Bagaimana jika campuran mengandung lebih banyak asam amino daripada asam amino yang digunakan sebagai perbandingan? Ini memungkinkan adanya bercak-bercak dari campuran yang tidak sesuai dengan asam amino yang dijadikan perbandingan itu. Anda sebaiknya mengulangi eksperimen menggunakan asam amino lain sebagai perbandingan.
Bagaimana kromatografi lapis tipis bekerja?

Fase diam silica gel

Silika gel adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan silica gel, atom silikon berlekatan pada gugus -OH.
Jadi, pada permukaan silika gel terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Gambar ini menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika.
Permukaan silica gel sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai di sekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol..
Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang kita sebutkan tentang silika gel kemudian digunakan serupa untuk alumina.

Apa yang memisahkan senyawa-senyawa dalam kromatogram?

Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama akan melarutkan senyawa-senyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa-senyawa akan cenderung bergerak pada lempengan kromatografi sebagaimana halnya pergerakan pelarut.

Bagaimana cepatnya senyawa-senyawa dibawa bergerak ke atas pada lempengan, tergantung pada:
·         Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut. Hal ini bergantung pada bagaimana besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.
  • Bagaimana senyawa melekat pada fase diam, misalnya silika gel. Hal ini tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan silika gel.
Anggaplah bercak awal mengandung dua senyawa, yang satu dapat membentuk ikatan hidrogen, dan yang lainnya hanya dapat mengambil　bagian interaksi van der Waals yang lemah.

Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada silika gel lebih kuat dibanding senyawa lainnya. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari senyawa yang lainnya. Penjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu substansi pada permukaan.

Penjerapan bersifat tidak permanen, terdapat pergerakan yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada permukaan silika gel dan yang kembali pada larutan dalam pelarut.

Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada silika gel untuk sementara waktu proses penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti bahwa semakin kuat senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas lempengan.

Dalam contoh yang sudah kita bahas, senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan menjerap lebih kuat daripada yang tergantung hanya pada interaksi van der Waals, dan karenanya bergerak lebih jauh pada lempengan.

Bagaimana jika komponen-komponen dalam campuran dapat membentuk ikatan-ikatan hidrogen?

Terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan yang sama dan dapat larut dalam pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini tidak hanya merupakan atraksi antara senyawa dengan silika gel. Atraksi antara senyawa dan pelarut juga merupakan hal yang penting-hal ini akan mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa ditarik pada larutan keluar dari permukaan silika gel.

Bagaimanapun, hal ini memungkinkan senyawa-senyawa tidak terpisahkan dengan baik ketika anda membuat kromatogram. Dalam kasus itu, perubahan pelarut dapat membantu dengan baik-termasuk　memungkinkan perubahan pH pelarut.

Ini merupakan tingkatan uji coba ? jika satu pelarut atau campuran pelarut tidak berkerja dengan baik, anda mencoba pelarut lainnya. (Berikan tingkatan dimana anda dapat bekerja, seseorang telah bekerja keras untuk anda dan anda hanya menggunakan campuran pelarut yang telah anda berikan dan segala sesuatunya akan bekerja dengan sempurna!)




Aplikasi penyerap untuk KLT
Zat padat
Aplikasi
Silika
Asam amino, alkaloid, gula, asam lemak, lipid, minyak esensial, sterol, terpenoid, anion, kation
Alumina
Alkaloid, zat warna, fenol, steroid, vitamin, karoten, asam amino
Kieselguhr
Gula, oligosakarida, asam lemak, trigliserida, asam amino, steroid
Selulose
Asam amino, alkaloid, nukleotida
Pati
Asam amino
Sephadex
Asam amino, protein














.

Untuk campuran yang tidak diketahui, lapisan pemisah (sifat penjerap) dan sistem larutan pengembangan harus dipilih dengan tepat karena keduanya bekerja sama untuk mencapai pemisahan. Selain itu, hal yang juga penting adalah memilih kondisi kerja yang optimum yang meliputi sifat pengembangan, atmosfer bejana, dan lain-lain. Untuk memperoleh hasil yang dapat dibandingkan pada KLT, beberapa kondisi harus diperhatikan. Kondisi baku ini meliputi ;

A. Fase diam (lapisan penjerap)
Lapisan dibuat dari salah satu penjerap yang khusus digunakan untuk KLT. Untuk analisis, tebalnya 0,1 – 0,3 mm, biasanya 0,2 mm. Sebelum digunakan, lapisan disimpan dalam lingkungan yang tidak lembab dan bebas dari uap laboratorium. Penjerap yang umum adalah silika gel, aluminium oksida, kiesel gel, selulosa dan turunannya, poliamida, dan lain-lain. Perlu diingat bahwa penjerap seperti aluminium oksida dan silika gel mempunyai kadar air yang berpengaruh nyata terhadap daya pemisahannya.

B. Fase gerak (pelarut pengembang)
Fase gerak adalah medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Fase ini bergerak di dalam fase diam, yaitu suatu lapisan berpori, karena ada daya kapiler. Yang digunakan hanyalah bertingkat mutu analitik dan, bila diperlukan. sistem pelarut multikomponen ini harus berupa suatu campuran sesederhana mungkin yang terdiri atas maksimum tiga komponen. Pada KLT jerap, pelarut dapat dikelompokkan ke dalam deret eluotropik berdasarkan efek elusinya. Efek elusi naik dengan kenaikan kepolaran pelarut. Misalnya, heksana nonpolar mempunyai efek elusi lemah, kloroform cukup kuat, dan ), memberiÎmetanol yang polar efek elusinya kuat. Tetapan dielektrik (angka TD,  informasi mengenai kepolaran suatu senyawa. Laju rambat tergantung kepada viskositas pelarut dan tentu juga kepada struktur lapisan (misalnya butiran penjerap).

C. Bejana pemisah, penjenuhan, pengisian
Bejana harus dapat menampung pelat dan tertutup. Pengisian fase gerak harus sesuai dengan kedalaman lapisan yang terendam. Untuk kromatografi dalam bejana yang jenuh, secarik kertas saring bersih ditaruh pada dinding sebelah dalam bejana terbentuk U dan dibasahi dengan pelarut pengembang. Tingkat kejenuhan bejana dengan uap pelarut pengembang mempunyai pengaruh yang nyata pada pemisahan dan letak bercak pada kromatogram. Jika pelarut pengembang naik dalam lapisan, sebagian menguap di daerah garis depan pelarut pengembang itu. Jadi, untuk jarak pengembangan yang sama, laju aliran pelarut pengembang lebih cepat di dalam bejana tanpa kertas saring; demikian pula letak bercak lebih tinggi dibandingkan bercak yang berbentuk pada bejana yang dijenuhkan sempurna dengan uap pelarut pengembang.

D. Awal dan jumlah cuplikan
Bercak atau pita ditotolkan pada jarak 15 mm dari tepi bawah lapisan. Jarak suatu bercak awal, yang berukuran 3 – 5 mm, ke bercak awal lainnya dan jarak antara bercak paling pinggir dengan tepi samping sekurang-kurangnya 10 mm. Lapisan tidak boleh rusak selama penotolan cuplikan itu. Biasanya ditotolkan 1 – 10 µl larutan cuplikan 0,1 – 1%. Untuk menotolkan dapat digunakan alat mikropipet berujung runcing atau pipa kapiler.

E. Pengembangan
Pengembangan ialah proses pemisahan campuran cuplikan akibat pelarut pengembang merambat naik dalam lapisan. Jarak pengembangan normal, yaitu jarak antara garis awal dan garis depan, ialah 100 mm. Di samping pengembangan sederhana, yaitu perambatan satu kali sepanjang 10 cm ke atas, pengembangan ganda dapat juga digunakan untuk memperbaiki efek pemisahan yaitu dua kali merambat 10 cm ke atas berturut-turut pada pengembangan dua kali. Lapisan KLT harus dalam keadaan kering di antara kedua pengembangan tersebut ; ini dilakukan dengan membiarkan pelat di udara selama 5 – 10 menit.

F. Larutan pembanding
Di samping larutan cuplikan, selalu ada suatu campuran pembanding yang dikromatografi pada waktu yang bersamaan. Campuran ini senyawa yang diketahui dengan konsentrasi yang diketahui pula. Bila mungkin, senyawa pembanding sama dengan senyawa cuplikan atau berbeda akan tetapi punya daya rambat yang sama.

G. Larutan cuplikan
Membuat larutan cuplikan secepat-cepatnya dan sesederhana mungkin adalah penting. Waktu yang dipakai jangan sampai melebihi waktu kromatografi.

H. Deteksi senyawa yang diperoleh
Dapat dilakukan berbagai cara mendeteksi senyawa yang dipisah tergantung dari sifat fisiko-kimia dari senyawa tersebut. Misalnya, menggunakan lampu UV untuk eksitasi fluoresensi di mana senyawa tersebut menunjukkan penyerapan pada daerah UV; deteksi dengan pereaksi semprot di mana memberikan warna setelah disemprot; metode deteksi biologi di mana mendeteksi secara khas senyawa yang mempunyai aktivitas fisiologi tertentu, maka digunakan prosedur uji biologi.
Sumber:  Chem-is-try.org. situs.web kimia Indonesia. Maret 2009
                                                                                                     Hardjono, S. (1985). Kromatografi. Yogyakarta: Liberty
                                                                                                     Johnson, E.L. dan Stevenson, R. (1978). Basic Liquid Chromatography.

LATIHAN SOAL

1. Dalam suatu pemisahan dengan KLT nilai Rf untuk senyawa yang tidak diketahui
adalah 0,809. Tinggi permukaan untuk senyawa A, B, dan C masing-masing adalah 24, 28, dan 30 cm, sedangkan untuk pelarutnya 34 cm. Tentukan senyawa yang tidak diketahui tersebut.

2. Jelaskan perbedaan antara kromatografi kertas dengan KLT.

3. Jelaskan bagaimanakah analisis kuantitatif dengan KLT?

4. Berikan alasan mengapa resolusi pemisahan dengan KLT jauh lebih tinggi bila dibandingkan dengan kromatografi kertas?



0 Response to "kromatografi lapis tipis"

Posting Komentar

Langganan: Posting Komentar (Atom)