spektrofotometri uv-vis
Spektrofotometri Sinar Tampak (UV-Vis)
adalah pengukuran energi cahaya oleh suatu sistem kimia pada panjang
gelombang tertentu (Day, 2002). Sinar ultraviolet (UV) mempunyai panjang
gelombang antara 200-400 nm, dan sinar tampak (visible) mempunyai
panjang gelombang 400-750 nm. Pengukuran spektrofotometri menggunakan
alat spektrofotometer yang melibatkan energi elektronik yang cukup besar
pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometer UV-Vis lebih
banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif.
Spektrum UV-Vis sangat berguna untuk pengukuran secara kuantitatif.
Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur
absorban pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan hukum
Lambert-Beer (Rohman, 2007).
Hukum Lambert-Beer menyatakan hubungan linieritas antara absorban dengan konsentrasi larutan analit dan berbanding terbalik dengan transmitan. Dalam hukum Lambert-Beer tersebut ada beberapa pembatasan, yaitu :
- Sinar yang digunakan dianggap monokromatis
- Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang yang sama
- Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap yang lain dalam larutan tersebut
- Tidak terjadi fluorensensi atau fosforisensi
- Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan
A = e.b.c
dimana :
A = absorban
e = absorptivitas molar
b = tebal kuvet (cm)
c = konsentrasi
TAHAPAN PENENTUAN KADAR SAMPEL SECARA SPEKTROFOTOMETRI
1. Penentuan panjang gelombang maksium (?max)
Definisi: panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal, dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku pada konsentrasi tertentu
Alasan mengapa dipergunakan panjang gelombang maksimum dalam pemeriksaan spektrofotometri, sbb :
- panjang gelombang max memiliki kepekaan maksimal karena terjadi perubahan absorbansi yang paling besar
- Pada panjang gelombang max bentuk kurva absorbansi memenuhi hukum Lambert-Beer
Hal yang perlu diperhatikan pada penentuan ?max sbb :
Absorban yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara 0,2 sampai 0,8 atau 15% sampai 70% jika dibaca sebagai transmitans. Anjuran ini berdasarkan anggapan bahwa kesalahan dalam pembacaan T adalah 0,005 atau 0,5% (kesalahan fotometrik). (Rohman, A. 2007)
2. Penentuan Operating Time (OT)
TUJUAN : untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil yaitu saat sampel bereaksi sempurna dengan reagen warna . Waktu kerja ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi larutan
3. Pembuatan Kurva Larutan Baku Linier
TUJUAN : untuk memperoleh persamaan larutan baku dalam penentuan kadar sampel
Tahapan yang diperlukan sbb :
a. Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai konsentrasi.
b. Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi diukur pada ?max (berdasarkan hasil ?max yang diperoleh dari tahap 1) dan Operating Time (berdasarkan waktu yang diperoleh pada tahap 2)
c. Membuat Kurva Larutan Baku yang merupakan hubungan antara konsentrasi (sumbu y) dan absorbansi (sumbu x).
d. Bila hukum Lambert-Beer terpenuhi maka kurva baku berupa garis lurus.
e. Paling sedikit menggunakan 5 rentang konsentrasi yang meningkat yang dapat memberikan serapan linier
f. Kemiringan atau slope adalah nilai e (absorptivitas molar).
g. Nilai R antara 0,70 – 1,00 (pertanda terbentuk garis lurus linear pada rentang konsentrasi yang dibuat)
Apabila persyaratan pembuatan kurva baku di atas tidak terpenuhi maka penyimpangan dari garis lurus biasanya dapat disebabkan oleh: (i) kekuatan ion yang tinggi, (ii) perubahan suhu, dan (iii) reaksi ikutan terjadi.
4. Penentuan Kadar Sampel
Penentuan kadar sampel metode regresi linier yaitu metode parametrik dengan variabel bebas (konsentrasi sampel) dan variabel terikat (absorbansi sampel) menggunakan persamaan garis regresi Kurva Larutan Baku. Konsentrasi sampel dapat dihitung berdasarkan persamaan kurava baku tersebut (Rohman, 2007).